Cellules chimiosensibles cette souche, dérivée de la souche B d'Escherichia coli, présente l'avantage d'être déficiente en protéases lon et OMPT et est l'une des bactéries hôtes d'expression couramment utilisées, dont le mode opératoire est le suivant:
1, les cellules chimiosensibles sont sorties de - 80 ℃, rapidement insérées dans la glace, 6 minutes plus tard, la masse à faire fondre, ajouter l'ADN cible (plasmide ou produit de liaison) et mélanger doucement avec le fond du tube EP coulissant à la main (éviter l'aspiration au pistolet), laisser reposer dans La glace pendant 25 minutes.
2, 42 ℃ bain d'eau chaud pendant 45 secondes, remettre rapidement sur la glace et laisser reposer pendant 5 minutes, l'agitation réduira l'efficacité de conversion.
3, ajouter 0,9 ml de température ambiante s.o.c. (s.o.c. est riche en nutriments, peut améliorer l'efficacité de conversion) ou de milieu LB dans le tube de centrifugation.
4, 30 ℃, 250 RPM réanimation pendant 60 minutes. Lorsque le plasmide contient un fragment instable, une culture à 30 ° C réduit la probabilité de recombinaison incorrecte, si la conversion controlpuc19 calcule l'efficacité de conversion, il faut 37 ° C, 225 tr / min de réanimation pendant 60 minutes
5, la plaque de criblage est sortie à l'avance pour mettre 30 ℃ incuber pour maintenir la température de la plaque à 30 ℃, aspirer 50 - 100 μl appliquer directement sur la plaque de criblage ou centrifuger 5000rpm pendant une minute pour la moisissure, laisser environ 100 μl sur la plaque de criblage et souffler doucement les morceaux de Suspension lourde et appliquer sur le milieu LB contenant l'antibiotique correspondant.
6, placez les plaques à l'envers à 30 ℃ pour la culture pendant 20 - 24 heures ou 37 ℃ pour la culture pendant la nuit. Lorsque le plasmide contient un fragment instable, une culture à 30 °C réduit la probabilité d'erreur de recombinaison, et si la conversion controlpuc19 calcule l'efficacité de conversion, une culture à 37 °C est nécessaire pendant une nuit.
Note sur les cellules chimiosensives:
Le clonage de fragments d'ADN labile ou la construction de vecteurs rétroviraux / lentiviraux, après plaque, doit être cultivé à 30 ° C pour réduire la probabilité de recombinaison erronée.
2, lors de la préparation de plasmides viraux de haute pureté, les bactéries de ligature de plaque fraîchement transformées doivent être utilisées, le liquide bactérien frais extrait le plasmide, le liquide bactérien ne peut pas être utilisé après la conservation à basse température.
3, les clones instables ou les plasmides viraux sont préférentiellement conservés à l'état plasmidique, essayez d'éviter de conserver le plasmide dans les cellules d'e. Coli.
Les cellules chimiosensibles fondent généralement lentement dans la glace. L'ADN cible est ajouté dans les 10 minutes suivant l'insertion dans la glace, ne peut pas être laissé trop longtemps dans la glace et un stockage prolongé réduit l'efficacité de la transformation. L'ADN de destination doit être mélangé en douceur.
5, la conversion de concentrations élevées de plasmides ou de produits de liaison à haute efficacité peut réduire en conséquence la quantité de bactéries utilisées pour enduire la plaque.