La classe Junior et tout le monde a parléELISA Methodology Development Practice Edition - développement de méthodes quantitatives pour la détection de macromolécules biologiques- Oui.
Ce numéro nous fait partager un autre sujet important: Elisa Methodology Development Practice Edition - Affinity Determination Method Development.

I. Préface

Les méthodes actuellement utilisées pour déterminer l'affinité entre Ligands récepteurs, c'est - à - dire la constante d'équilibre de dissociation, sont principalement:

1. Méthode de détermination thermodynamique
2. Méthode de détermination cinétique
3. Méthode de concentration saturée

Où la méthode de détermination cinétique et la méthode de concentration de saturation sont plus communes:Méthode de détermination cinétique(comme biacore)Impliquant des intrants instrumentaux relativement coûteux,La détermination de la concentration de saturation est une méthode de détermination couramment utilisée par la grande majorité des entreprises de médicaments biologiques du pays.

ELISA pour la détermination de l'affinité est le mode principal de la détermination de la concentration de saturation et est couramment utilisé pour l'évaluation de l'activité des protéines antigéniques ou des niveaux protéiques d'anticorps et l'évaluation de la stabilité des anticorps.
L'ELISA pour la détermination de l'affinité n'a souvent pas de kit commercial et nécessite un développement méthodologique par des expérimentateurs.

En raison du manque d'éducation dans ce domaine de la biotechnologie et de l'accumulation insuffisante de nouvelles applications dans les entreprises de recherche et développement de médicaments, une méthode de détermination de l'affinité ELISA qui peut être validée par des méthodes est une tâche difficile pour de nombreux praticiens, et il y a de fortes chances que des erreurs telles que des erreurs de transmission de nouveaux numéros ou des biais se produisent.
Une de ces utilisations fallacieuses est le développement de la méthode de détermination de l'affinité ELISA en utilisant des conditions expérimentales pour la quantification ELISA.

Cet article commence par les principes de base de la méthode de détermination de l'affinité, décrit les principes de base de la détermination de l'affinité par la méthode de concentration de saturation, décrit les relations de dosage des anticorps antigéniques au cours du développement de la méthode ELISA, ainsi que plusieurs erreurs qui peuvent survenir lors de l'utilisation de l'ELISA pour l'application de la méthode de détermination de l'affinité, et vous présente les méthodes générales de détermination de l'affinité et les protocoles préliminaires de développement méthodologique.

II. Concepts de base de l'affinité

Nous expliquons ce qu'on appelle l'affinité en analysant plusieurs cas de réactions chimiques.

例子A
L'hydrogène et l'oxygène produisent de l'eau dans des conditions enflammées.
A l'arrêt de la réaction, si les deux sont consommés lorsque la molarité de l'hydrogène dans l'environnement réactionnel est 2 fois supérieure à celle de l'oxygène, il n'y a que de l'eau dans l'environnement réactionnel; Si la molarité de l'hydrogène est supérieure à 2 fois la molarité de l'oxygène, l'oxygène est consommé et il n'y a que de l'hydrogène et de l'eau dans l'environnement réactionnel; Lorsque la molarité de l'hydrogène est inférieure à 2 fois la molarité de l'oxygène, l'hydrogène est consommé et il n'y a que de l'oxygène et de l'eau dans l'environnement réactionnel.
Il s'agit de la connaissance de base des réactions chimiques, les résultats des réactions chimiques, les réactifs sont capables de devenir des générateurs, c'est - à - dire que les réactions peuvent se produire jusqu'à la fin, les réactions qui ont des caractéristiques de processus et de résultats de telles réactions sont appelées réactions irréversibles.

例子B
Antigène pd1(CD279)Et pd1 anticorps(comme PEle mbrolizumab)Réagir à température normale et pression normale.
A l'arrêt de la réaction, si la concentration molaire en cd279 dans le milieu réactionnel est de 200 nm et la concentration molaire en pembrolizumab de 100 nm, la concentration du complexe pembrolizumab - cd279 est de 97,86 nm, la concentration molaire en cd279 de 4,28 nm et la concentration molaire en pembrolizumab de 2,14 nm dans des conditions idéales;
Si la concentration molaire de cd279 dans l'environnement réactionnel est de 100 nm et que la concentration molaire de pembrolizumab est de 200 nm, dans des conditions idéales, la concentration du complexe pembrolizumab - cd279 est de 49,81 nm, la concentration molaire de cd279 est de 0,38 nm et celle de pembrolizumab de 159,19 nm.

Exemple C
Antigène pd1(CD279)Et l'antigène pdl1(CD274)Réagir à température normale et pression normale.
Si la concentration molaire en cd279 dans l'environnement réactionnel est de 200 nm et que la concentration molaire en cd274 est de 100 nm, la concentration du complexe cd274 - cd279 est de 2,35 nm, la concentration molaire en cd279 est de 197,65 nm et la concentration molaire en cd274 est de 97,65 nm dans des conditions idéales à la fin de la réaction;
Si la molarité du cd279 dans l'environnement réactionnel est de 100 nm et que la molarité du cd274 est de 200 nm, la concentration du complexe cd274 - cd279 est de 2,35 nm, la molarité du cd279 est de 97,65 nm et la molarité du cd274 est de 197,65 nm dans des conditions idéales à la fin de la réaction, La grande majorité du cd279 et du cd274 n'étant pas impliquée dans la réaction.
Cas B, c deux cas, qu'il s'agisse d'antigènes et d'anticorps(Ligands et récepteurs)En combinaison avec la réaction, les deux réactions ont un processus de réaction positif pour générer un complexe, il y a également une réaction de dissociation du complexe pour générer un antigène, un processus de réaction inverse d'anticorps, le résultat final est un antigène, un anticorps et un complexe antigène - anticorps coexistent dans l'état des trois.

Une telle réaction est appeléeRéaction réversible- Oui.
Lorsque les vitesses de réaction positive et inverse sont égales dans une réaction réversible, la concentration de l'antigène dans le système réactionnel, la concentration de l'anticorps et la concentration du complexe antigène - anticorps n'augmentent plus et ne diminuent plus, la réaction réversible est terminée et la concentration molaire de chaque composant dans le système réactionnel est en équilibre dynamique.

Affinité(Affinité)Est un paramètre caractéristique de l'état relatif entre l'antigène, l'anticorps et le complexe antigène - anticorps au cours de la réaction réversible, dont le nom plus spécialisé et plus terminologique est la constante d'équilibre de dissociation KD en mol / l(en accord avec les unités de concentration)- Oui.

Plus la valeur d'affinité est faible, plus l'affinité est forte, et la force et la faiblesse de l'affinité déterminent le nombre relatif de composants de la réaction réversible lorsque la réaction finale est terminée.

Comme dans les exemples B et C sont également 200 nm cd279(PD1)Réactions, anticorps pembrolizumab(anticorps pd1)L'affinité par rapport au cd279 est de 0,4 nm, le Ligand cd274(PDL1)Avec une affinité de 8200 nm par rapport au cd279, la réaction finale a généré un complexe pembrolizumab - cd279 de 97,86 nm, alors que le complexe cd274 - cd279 n'a que 2,35 nm, soit une différence de 42 fois.

A la différence des réactions irréversibles, outre la molarité de l'antigène - anticorps, l'antigène et l'anticorps(Ligands et récepteurs)L'affinité entre les deux * affectera la quantité de produit dans la réaction réversible.

Iii. Connaissez - vous les principes de base de l’elisa lorsqu’il s’agit de développer une méthodologie?

Pour un aperçu des méthodes et des principes de détermination de l'affinité, le lecteur peut se référer à l'article Évaluation de l'affinité sur les techniques d'évaluation préalable bio - fonctionnelle.
Cet article généralise principalement la méthode des concentrations saturées.
RreprésentantLe récepteurouAntigènes,LreprésentantLigandsouAnticorps- Oui.
En utilisant la méthode de concentration saturée, si l'on veut déterminer l'affinité du Ligand vis - à - vis du récepteur, en présence d'une petite quantité de R, on effectue une dilution graduée de l, on détecte la concentration du complexe R - L, la valeur de la concentration correspondent à l lorsque la concentration du complexe R - l représente la moitié de la concentration totale de R.(EC50)Soit la valeur KD de l par rapport à R.
Le complexe RL / R, c'est - à - dire la valeur du signal pour laquelle la valeur de B peut être détectée, est remplacé par une relation fonctionnelle entre l dilué en gradient et le signal répondant à la formule ci - dessous, seule la valeur EC50 pouvant ici être équivalente à la valeur KD dans des conditions expérimentales particulières.
Il existe plusieurs points clés pour la détermination de la valeur de KD par la méthode de concentration saturée,C'est - à - dire que les deux molécules qui interagissent, r pour une petite quantité et l pour effectuer une dilution continue du gradient, doivent obtenir la valeur de la réponse du signal(tous les sites de liaison de R sont occupés par l)C'est - à - dire la période de plateau, alors dans ces conditions, occupant la moitié de R, la concentration en l requise(EC50)Valeur KD.
La méthode de concentration de saturation détermine principalement les valeurs du signal représentatif du complexe RL, et la méthode de détermination peut être la cytométrie en flux, le marquage isotopique, la polarisation fluorescente ou ELISA.

Iv. Mise au point de méthodes ELISA pour la détermination de l'affinité méthodes couramment utilisées

Disposition

Processus opérationnel général

01Préparation d'une plaque - étalon enzymatique: prendre une concentration de 100 µg / ml d'antigène, dissoudre à température ambiante, mélanger le sachet est dilué par le liquide comme suit à 0,2 µg / ML, 0,5 µg / ML, 1 µg / ML, ajouter 100 µl / puits selon le schéma d'addition, ajouter séparément dans La plaque - étalon enzymatique(Note 1), dans lequel le package est ajouté en liquide pour le package en anticorps de contrôle, 2 - 8 ° C pendant la nuit;
02Laver la plaque 3 fois avec le liquide de lavage, sécher en tapotant, ajouter 300 µl / puits de liquide de fermeture(Note 2)Fermeture à température ambiante pendant 1 heure; Le liquide de lavage lave la plaque 3 fois, à sec pour l'utilisation;
03Diluer les anticorps selon la disposition avec un gradient de départ 3x de 100000ng / ml(Note 3), selon la disposition, 100 µl / puits sont ajoutés dans la microplaque;
04Mettre enOscillateur microplaque ohaus (ISLDMPHDG)Intérieur, réglage 37°c, 600 RPM d'oscillation pendant 1 heure;

05Laver la plaque 3 fois avec le liquide de lavage, sécher;
06Anticorps enzymatiquement liés dilués à une concentration appropriée(Note 4), dansLe vortex ohaus(VXMNFS)hautMélange, 100µl / puits;

07Mettre à l'intérieur de l'oscillateur microplaque, régler 37 ℃, 600rpm Oscillation pendant 1 heure;
08Laver la plaque 4 fois avec le liquide de lavage, sécher;
09Prendre l'anticorps enzymatique lié au liquide chromogène correspondant, sortir l'équilibre à la température ambiante 20 minutes avant l'application et mélanger sur un mélangeur à tourbillon;
10Ajouter le liquide chromogène à 100 µl / puits à l'aide d'un pistolet à 8 Voies;
11Liquide de rendu des couleurs température ambiante à l'abri de la lumière 10 - 30 minutes(Note 5);
12Fin de la réaction à l'aide d'un pistolet à 8 Voies avec ajout de liquide de terminaison à 100 µl / puits(selon le substrat, cette étape peut ne pas être nécessaire);
13Détermination de la valeur du signal avec un étalon enzymatique(Note 6);
14Analyse des résultats(Note 7)- Oui.

Petite note intime

Note 1 :Si une concentration élevée d'anticorps au cours de la réaction doit être réduite(100 000 ng/ml)Adsorption non spécifique sur les plaques - étiquettes enzymatiques, au cours du processus de conditionnement, il est recommandé de choisir des plaques - étiquettes enzymatiques hydrophobes(polystyrène)La concentration de l'antigène encapsulé nécessite une petite quantité de 0,2 - 1 µg / ML, les cas spécifiques doivent être jugés optimisés en fonction de la taille de l'affinité de l'anticorps antigénique. En général, plus l'affinité est forte, plus la concentration de l'encapsulation d'antigène requise est faible.
Note 2 :Liquide de fermeture ne peut pas nécessairement agir comme un effet de fermeture, nécessite une validation expérimentale(regroupement d'antigènes non encapsulés)En général, le plus petit poids moléculaire de l'effet de blocage est meilleur.
Note 3 :Au début du développement de la méthodologie, vous pouvez élargir la plage de concentration de la courbe standard de 100 000 ng / ML à 0,1 ng / ML pour obtenir une courbe complète avec une phase de plateau nettement supérieure et inférieure, lorsque l'affinité antigène - anticorps est forte, la concentration en gradient peut être réduite et le multiple de dilution peut être réduit à 2 fois dans le processus d'optimisation de la méthodologie.
Note 4 :L'effet d'anticorps lié à l'enzyme est excessif, la dilution de l'anticorps lié à l'enzyme doit faire différentes dilutions pour la sélection comparative, pour l'anticorps lié à l'enzyme du composant monoanticorps, si les deux dilutions de l'anticorps lié à l'enzyme sont capables de produire la même courbe de dose, indiquant que l'excès d'anticorps lié à l'enzyme, la transmission du signal ELISA n
Pour les anticorps enzymatiques Multi - composants anti - enzymatiques, dont le jugement de la dilution est plus complexe, on peut d'abord calculer que la molarité de l'anticorps enzymatique inférieur doit être plus de 5 fois supérieure à la molarité de l'antigène sur le paquet. Lorsque les concentrations d'anticorps enzymatiques sont faibles, les anticorps enzymatiques sont capturés à des doses élevées de différentes concentrations d'anticorps, la courbe ayant un faux plateau supérieur.
Note 5 :Pour les substrats de valeur d'Absorbance et les substrats fluorescents, la valeur du signal et le temps de rendu des couleurs détectés par l'instrument sont proportionnels, le contrôle à 10 - 30 minutes est approprié. Il est nécessaire de confirmer à l'avance la plage linéaire du signal de l'instrument de détection, par exemple, la plage linéaire du signal de la valeur d'Absorbance de l'étalon enzymatique général est de 0 à 3, la valeur d'Absorbance entre 3 et 4 est non linéaire, dans le rendu des couleurs doit contrôler la valeur du signal ne dépasse pas 3, lorsque la valeur du signal dépasse la plage linéaire, la courbe a un faux plateau supérieur.
Note 6 :Différents substrats doivent être détectés avec différents instruments, valeurs de lecture d'Absorbance, valeurs de lecture de fluorescence, valeurs de lecture de chimiluminescence. Lors de la sélection du substrat, Notez si l'étalon enzymatique du laboratoire possède ce type de fonction de lecture.
Note 7 :Ajustement de la courbe de dose standard généralement ajusté avec quatre paramètres, il doit y avoir une période de plate - forme ascendante et descendante évidente(A, valeur de d)La pente est généralement de 0,8 - 1,2(valeur b)Entre, EC50（Valeur c)C'est - à - dire la valeur de l'affinité de l'anticorps par rapport à l'antigène.

V. Résumé

Selon la méthode de la concentration saturée, il est nécessaire d'avoir une courbe de type s à quatre paramètres distincte pour la détermination de l'affinité par ELISA, c'est - à - dire qu'il est nécessaire d'avoir une courbe de signal qui varie progressivement avec la concentration en anticorps.
Il y a une phase plate - forme ascendante et descendante marquée aux concentrations faibles et élevées d'anticorps, la moitié de la valeur du signal de la phase supérieure correspondant à la concentration d'anticorps(EC50)La valeur est la valeur KD de l'affinité antigène - anticorps.
La plage de linéarité du signal de détection de l'instrument étant limitée, lorsque le signal dépasse la plage de linéarité, la courbe passe en faux palier supérieur, de sorte que l'affinité mesurée n'est pas satisfaisante.
La concentration en antigène du paquet détermine directement la valeur du signal,Ainsi, lors de la détermination de l'affinité par ELISA, la concentration d'antigène du paquet est aussi faible que possible pour obtenir une valeur de signal appropriée; Une concentration trop faible en anticorps enzymatiques peut également faire entrer la courbe dans une phase de faux plateau.

La transmission linéaire d'un excès d'anticorps enzymatique lié à un signal au cours du développement de la méthode ELISA nécessite une validation expérimentale.
Lorsque le signal ne parvient pas à obtenir une phase de plateau supérieure efficace, cela signifie que l'affinité entre les anticorps antigéniques est trop faible ou que les paquets sont surchargés d'antigènes et qu'une plus grande concentration d'anticorps est nécessaire pour que tous les antigènes soient saisis pour atteindre la phase de plateau.
Limité par les limites de la sensibilité ELISA, faible dans certaines affinités(> 100 nM)Parmi les antigènes d'anticorps, l'utilisation de la méthode ELISA ne permet pas d'obtenir des valeurs valides de la phase de plateau, ni d'affinité mesurée.
ELISA effectue un test d'affinité pour évaluer l'activité de l'antigène ou pour déterminer l'activité de l'anticorps, la CE50 résultante n'est pas plus petite, mieux c'est, le signal entre en phase de faux Plateau(la limite de détection de l'instrument est atteinte, la concentration de liaison enzymatique est faible)Cela rend l'EC50 plus petit, ce qui donne des données d'affinité erronées, ce qui est également une erreur facile à produire lorsque l'ELISA effectue une détermination d'affinité.
Aujourd'hui, de nombreux fournisseurs de protéines antigéniques évaluent l'activité antigénique de manière erronée.

L'affinité entre l'antigène et l'anticorps est déterminée par la structure et l'interaction des deux,Il peut s'agir de 0,1 nm, 1 nm ou 1 000 nm. Pour évaluer le bien ou le mal d'un test d'affinité ELISA, il est nécessaire de voir si cette valeur de CE50 correspond à la valeur de l'affinité, qui peut être vérifiée de manière multidimensionnelle par des méthodes telles que les tests thermodynamiques, les Tests cinétiques et les tests de flux cellulaire dans la méthode de concentration de saturation.
Inversement, lorsqu'une méthode ELISA n'existe pas telle qu'un signal entrant dans une période de fausse plate - forme(la limite de détection de l'instrument est atteinte, la concentration de liaison enzymatique est faible)Lorsqu'il est faux, sa valeur EC50 peut être vraie pour la valeur de l'affinité de réaction.

L'utilisation d'ELISA pour le développement méthodologique nécessite des objectifs d'application clairs, la quantification des macromolécules et la détermination de l'affinité.
Différents objectifs d'application, la concentration relative de dose d'antigène et d'anticorps variera considérablement, il existe différentes courbes de dose,Les lecteurs peuvent faire une étude comparative en conjonction avec le précédent ELISA Methodology Development Practice Edition - Quantitative Method Development for Biomacromolecule Detection, clarifiant les différences.

Ce numéro de partage est là, nous y reviendrons!

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