La saison scolaire est de retourExpérimental VangEncore une fois, va "déplacer les briques".
CommentExcellentLa brique de yaencorePas besoin d'aideFrère et sœur

Bien sûr que ouiAttention« Little o Classroom »ColonnesC'est ça.

Aujourd'hui Xiao Ao vous présente
Est unePlein de marchandises sèchesde
Manuel pratique des méthodes de présentation des phages
« amplification et quantification des phages »

C'est une rare note d'apprentissage
Veuillez prendre (Collection)!

Partie 1

Hybridome、Clonage unicellulaireetTechnologie de présentation de phagesSont les trois principales techniques de découverte d'anticorps, parmi lesquellesTechnologie de présentation de phagesCommeTechnologie au niveau nor AwardA un rôle très important dans le processus de recherche et développement de médicaments bio - innovants,* accélère le processus de recherche et développement de médicaments anticorps.Technologie de présentation de phagesNon seulement il a un rôle central dans la découverte et l'optimisation de nouveaux anticorps et Polypeptides, mais il est également couplé avec la technologie traditionnelle de l'immunité animale pour un amarrage efficace avec des nano - anticorps, une plate - forme de découverte de souris transgéniques d'origine humaine,Capable d'être largement utilisé dans des domaines tels que les anticorps, les médicaments couplés aux anticorps et car - t / TCR - t- Oui.Cet article explorera, partagera l'expérience d'un processus expérimental spécifique pour les détails expérimentaux de prolifération et d'amplification de phages techniques d'affichage, en utilisant son principe pour guider fondamentalement le processus expérimental afin d'exceller dans le processus expérimental et d'augmenter le succès de la technologie d'affichage de phages dans le processus de découverte d'anticorps.

Partie 2

– Bibliothèque de bactériophages
Principes de base de l'amplification et de la présentation |

Le système maintenant couramment appliqué de phages montrant des fragments d'anticorps appelleLe « système 3 + 3 »(3 est la protéine de capside P3 du phage);3 + 3Représente que la protéine de capside P3 a deux sources:

• Phagemid (Granule bactériophage)
• Le phage m13ko7 (Helper phage)

Grains de bactériesLa protéine P3 sur (phagemid) fusionne les gènes du fragment d'anticorps et est la clé de la diversité de la Banque;Bactériophages auxiliairesLa protéine P3 sur (Helper phage) est une protéine P3 naturelle du Phage.
* Le plasmide bactériophage est un vecteur plasmidique relativement petit qui a une efficacité de transformation élevée dans l'état sensible à E. coli et qui peut être amplifié dans E. coli.

Après avoir été infecté par un phage auxiliaire, E. coli contenant des phages est amplifié à l'aide du système enzymatique, des matières premières et de l'énergie d'e. Coli, et le phage contenant finalement les phages est libéré d'e. Coli, dont la protéine de capside P3 révèle un fragment d'anticorps.

Partie 3

– pendant l’amplification des phages
Difficultés rencontrées et solutions correspondantes |

Le processus de construction d'un bactériophage est en fait un processus de transmission de la diversité génétique des fragments d'anticorps:
Le processus de transmission de la diversité des gènes d'anticorps dans un échantillon de sang aux Granules bactériophages, qui est ce que la Banque de granules bactériophages construit;
Le passage de la diversité des plasmides bactériophages à la diversité des Escherichia coli contenant des plasmides bactériophages est le contenu des plasmides bactériophages E. coli électrotrans;
Le passage de la diversité d'Escherichia coli contenant des phages à la diversité des phages est le contenu de l'amplification des phages et une préoccupation pour l'expérience expérimentale de cet article.

Le but final de l'amplification du bactériophage est de transformer une seule copie du gène du fragment d'anticorps dans le bactériophage en 10 à 100 copies par le processus d'amplification du bactériophage,Et ces gènes copies sont capables de présenter des fragments de protéines d'anticorps sur la protéine P3 à la surface du bactériophage.

Pour que la diversité de la banque soit maintenue et transmise lors de l'amplification des phages, il est nécessaire de déterminer, en fonction de la taille initiale de la Banque, le nombre et le volume d'Escherichia coli contenant des phages au cours de l'amplification, la quantité de phages auxiliaires incorporés pour une infection efficace et la quantité de phages contenant des phages ajoutés après l'amplification pour la sélection, etc., questions qui nécessitent une évaluation calculée une par une,Le volume d'amplification nécessaire lors de l'amplification pour les banques de bactériophages de différentes tailles de banque n'est pas le même.Il y a de fortes chances qu'un protocole expérimental solidifié entraîne une perte de diversité dans la bibliothèque.
Pour comprendre ces questions, commencez par avoir une connaissance préalable des bases suivantes:

( 👇 Ce qui suit est tout à l'honneur!!! ) et

1. Lecture de E. coli tg1 à od600: 1od représente une concentration bactérienne de 1E9 PCS / ML.
2. Les phages / phages auxiliaires ont une efficacité infectieuse relativement bonne lorsque tg1 est loggen *, avec des valeurs od600 de 0,4 à 0,8 pour tg1 loggen *.
3. Le taux de croissance de tg1 dans loggen * est de génération de 20 minutes et nécessite une attention particulière à la croissance de tg1, en prenant les bactéries à temps pour l'expérimentation.4. Le rapport moi des phages auxiliaires et tg1 à 20: 1 permet de garantir que tous les tg1 sont infectés.
5. Les bactériophages contenant des bactériophages sont capables d'infecter E. coli tg1 normal et de laisser les bactériophages dans tg1 et de les amplifier avec l'amplification de tg1, sans amplification du bactériophage en l'absence de bactériophage auxiliaire.
6.Les plasmides plasmidiques bactériophages contiennent * résistance, les phages auxiliaires contiennent * résistance.
7. Les bactériophages contenant des bactériophages peuvent être titrés en infectant des tg1 normales, des plaques gélosées enduites * résistantes par dilution Gradient.8.Les bactériophages contenant des bactériophages en mode 3 + 3 ont montré une efficacité relativement faible de la protéine de fragment d'anticorps de fusion P3, seulement 5% - 10%, et le titre des bactériophages ajoutés devrait être plus de 100 fois supérieur à la diversité de la Banque lors de la sélection.
Une autre question cruciale estLe bactériophage, en tant que virus, se propage facilement sous forme d'aérosol dans l'environnement d'un laboratoire contaminé dans l'air, infectant ainsi E. coli avec un facteur f positif.(Ça fait mal au cœur, risque ta vie pour porter des briques!)
DansExpériences associées à phage displayDoit être effectuée dans un laboratoire relativement ferméPour éviter la contamination par les bactériophages à E. coli,Surtout lors de la culture d'e. Coli tg1 normale. Le mode d'inactivation des phages est généralement l'irradiation UV pendant plus d'une demi - heure.
(une créature qualifiée, Vang, est un tueur de virus sentimental de Maud!)

Partie 4

– expansion des phagesAugmentation et quantification
Partage de processus expérimentaux spécifiques |

Voici un protocole expérimental d'amplification avec une banque de phages de taille de banque 1E9.
* Si la bibliothèque est trop grande ou trop petite, vous pouvez augmenter ou diminuer le volume proportionnellement.

Jour 1
(une journée à bouger les briques chauves)

1. Prélever 1 ml (nombre de bactéries 1e10) de la souche tg1 contenant le bactériophage dans un shaker de 250 ml contenant 100 ml de milieu 2xyt - GA,utiliserLe rocker ohaus37 degrés 220rpm Shaker à od600 est d'environ 0,5- Oui.2. Prendre 20 ml de liquide bactérien (nombre de bactéries 1e10) avec un od600 d'environ 0,5 et ajouter le phage auxiliaire M13 k07 avec Pfu de 2e11 selon un moi de 20: 1, en oscillant à 37 degrés 220 tr / min pendant une demi - heure pour l'infection.3. Prendre le liquide bactérien post - infection à utiliser dans un tube à centrifuger de 50 mlCentrifugeuse ohaus 5816rCentrifugation à 3200 g pendant 10 minutes, le milieu est éliminé pour éliminer l'inhibition par le glucose du milieu de l'expression de la protéine P3 fusionnée à la protéine fragment d'anticorps dans le bactériophage.4. Les masses de bactéries sont remises en suspension avec du milieu 2xyt - AK, le milieu est ajouté à 400 ML et les bactéries sont agitées pendant la nuit à 30 degrés 220 tr / min avec un shaker de 1 L.

Jour 2
(le deuxième jour de la calvitie de briques)

5.Diviser à parts égales 400 ml de liquide bactérien dans un grand flacon à centrifuger,utiliserCentrifugeuse ohaus 5816r Centrifugation à 10000g pendant 10 minutes, prendre le décapage et centrifuger à nouveau 10000g pendant 10 minutes,Enlever les débris bactériens résiduels.6. Ajouter 90 ml de solution de PEG à 400 ml de surnageant, incuber 1 heure à 4°C sous agitation douce, puisUtilisation avec fonction de contrôle à basse températureCentrifugeuse ohaus 5816r Centrifugation à 4 ℃ 10000g pendant 1 heure- Oui.7. Après élimination et remise en suspension des phages avec 10 ml de PBS, ajouter 2,5 ml de solution de PEG pour précipiter à nouveau.8. Incuber sur glace pendant 20 minutes, puisUtilisation avec fonction de contrôle à basse températureCentrifugeuse ohaus 5816r4 ℃ 10000g centrifugé pendant une demi - heure- Oui.9. Le surnageant est retiré, la solution résiduelle de PEG est aspirée avec du papier absorbant et 1 - 2 ml de bactériophage PBS resuspendu sont ajoutés pour le titrage.

Détermination du titre:
1. Dans un laboratoire compartimenté, prélever E. coli tg1 normal dans le milieu de 2xyt,utiliserLe rocker ohausValeur de 0,5 de Shaker à od600S'il n'est pas utilisé à temps, il peut être mis en veille à 4 ℃ pendant 2 heures.
2.Le plasma de phage amplifié à l'étape 9 est dilué 1e5 - 1e7 fois avec du PBS.
3. Prélever 10 µl d'une dilution de phage à 490 µl d'e. Coli tg1 de do 600 0,5,utiliserLe rocker ohaus 37 ℃ 220rpm Oscillation pendant une demi - heureEffectuer une infection.
4. Prélever 50 µl de liquide infectieux et l'appliquer uniformément dans une plaque d'agar contenant 2xyt - GA, laisser sécher et placer dans un incubateur à 37 ° C pendant une nuit. Et appliquer une plaque gélosée à E. coli tg1 non infecté comme témoin négatif.

Jour 3
(troisième jour de déplacement de briques chauves)

5. Nombre de clones dans des plaques gélosées de 2xyt - GA, calcul du titre du phage amplifié à partir du multiple de dilution
Titre du Phage (Pfu / ML) = (nombre de clones * 10 * 50 / 10 µl) * multiple de dilution
6.Les bactériophages 1e11 - 1e12 sont pris pour l'élution.

Formulation du réactif:
Milieu 2xyt:Extrait de levure 10,0 g/L+Tryptone 16,0 g/L+NaCl 5,0 g/L
Milieu 2xyt - ga:Milieu 2xyt + 100 µg / ml * + 1% (W / v) de glucose
Milieu 2xyt - ak:Milieu 2xyt + 100 µg / ml * + 50 µg / ml *
PEG溶液：20% (p/v) PEG 6000, NaCl 2,5 M

Partie 5
Instruments *:

(chaque jour de travail en tant que chercheur n'est pas seul, car il est accompagné par Ao)

Le bactériophage, en tant que virus, se propage facilement sous forme d'aérosol dans l'environnement d'un laboratoire contaminé dans l'air, nécessitant un laboratoire fermé où tous les instruments du laboratoire doivent être utilisés séparément.
OhausShaker de culture de charge légère thermostatiqueAvec une plage de vitesses de rotation de 100 - 12 tr / min, un volume dense et une grande puissance, il offre un excellent effet d'agitation à vos échantillons:

En outre, au cours de l'expérience de présentation du bactériophage, il y aura différents volumes, différentes vitesses de rotation et une étape de centrifugation nécessitant des conditions de 4 ° C, siAvecPlusieurs
CentrifugeuseRépondre au besoin d’expérimentationCrée un vide dans les actifs de l'équipement expérimental, causant un * gaspillage!- Oui!- Oui!

Ohaus5816r centrifugeuse multifonctionnelleEt rotor optionnel pour faciliter les expériences liées aux phages, une centrifugeuse pour tous les besoins expérimentaux!

Suivant Little Ao vous emmène à bord
"Aidez - vous à économiser de l'argent sur la recherche" cette voiture
Apprenez - vous la bonne laine µohaus

Allemagne*
Puissant, excellent effet centrifuge
Auhaus Frontier ™ Famille de centrifugeuses
Lancement« achetez - en un et obtenez - en un »* Activités

* modèle ci - dessous
Micro centrifugeuse haute vitesseLe FC5515R(modèle congelé)
Micro centrifugeuse haute vitesseFC5515(modèle non congelé)
Nouvelle microcentrifugeuse compacteFC5513
Montez dans la voiture maintenant, il est encore temps!

Détails s'il vous plaît piquer l'affiche pourrie, inscrivez - vous s'il vous plaît balayer le Code QR 👇

Envie d'en savoir plus surProduits de laboratoire ohausL'information? Veuillez entrer« lire l’article complet »Laissez un message, notre ingénieur professionnel viendra à la vitesse du feu pour vous servir!
▼